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第四节 自身抗体检测

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    抗核抗体(antinuclear antibody,ANA)

    ANA是最常出现于自身免疫性风湿病(结缔组织病)患者血清中的一组自身抗体的总称。其靶抗原为真核细胞核成分,但也包括某些细胞质和细胞骨架成分,无种属特异性和器官特异性。

    IIF法:正常人血清中ANA阴性(不同试剂盒判定阳性的滴度不同,有的为>1:40,有的定为>1:80,有的定为>l:100)。

    ELISA法:定性试验阴性;

    定量试验< 40U/ml。

    1.测定ANA对很多自身免疫性疾病有诊断价值,在不同疾病中,特别是风湿性疾病,其抗体谱有一定的特征性。重要的有:全身性红斑狼疮(SLE)、药物诱导的狼疮、混合性结缔组织病(MCTD),ANA检出率可达95%~100%;干燥综合症为70%~80%,进行性全身硬化症(PSS)检出率可达85%~95%,其他如类风湿性关节炎、多发性肌炎及皮肌炎、慢性活动性肝炎、溃疡性结肠炎等也有20%~50%的检出率。此外,桥本甲状腺炎、重症肌无力、多发性动脉炎等患者也可检出ANA。

    2.用荧光抗体法检测ANA时不同荧光图谱可见以下几点:

    (l)均质型:此型与抗组蛋白抗体、抗DNA抗体及抗核小体抗体引起,几乎所有活动性SLE患者均可检出此型抗体,但多种其他自身免疫性疾病此抗体的检出率也可达20%~30%。

    (2)周边型:此型抗体所针对的靶抗原是膜孔复合物和板层素。针对前者的抗体多见于SLE患者,针对后者的抗体可见于慢性自身免疫性肝炎的活动期。

    (3)斑点型:与此型相关抗体有抗U1nRNP、抗Sm、抗scI70、抗SS-B、抗SS-A、抗Ki、抗Ku及抗其他非组蛋白抗体,多见于混合型结缔组织病(MCDT,也可见于SLE和60%以上的进行性全身性硬化(PPS)患者。

    (4)核仁型:此型与核糖体、U3 -RNP、RNA聚合酶的抗体有关,除SLE外,硬皮病患者阳性率可达40%。

    (5)着丝粒型:抗着丝粒抗体对局限型全身性硬化症有很高的敏感性和特异性,阳性率可以达到80%~95%。

    3.测定结果判断受主观因素影响较大,因此荧光染色图谱只有相对参考意义,不能据此作出定论,必要时应进一步作特异性ANA检测。

    1.ELISA法影响因素较多,标本要防止溶血,因红细胞中含有过氧化物酶.红细胞裂解后造成标本溶血,过氧化物酶释放于血清中,与试剂中的辣根过氧化物酶作用相似,易造成假阳性。

    2.要注意hook效应,即标本含量过高时,由于抗原一抗体比例不合适,易出现假阴性结果。

    3.抗心律失常药物,如普鲁卡因胺、肼苯达嗪,异烟肼,苯妥英钠,保泰松等药物可引起假阳性。

    4.洗涤次数要适当,防止洗涤不彻底致假阳性或洗涤过多致假阴性,要严格按照试剂盒说明书要求进行操作。

    抗双链DNA抗体(anti-double stranded DNA antibody,an-ti-dsDNA)

    抗DNA抗体可分为两种基本:抗双链DNA抗体或天然DNA和抗单链或变性DNA。

    IIF法:正常人血清中抗dsDNA抗体滴度<1:10。

    RIA法:正常人血清中抗dsDNA抗体结合率≤0.20(20%)。

    1.抗ds-DNA自身抗体是SLE最重要的标志性自身抗体。

    2.抗ds-DNA抗体对SLE特异性很高,尤其当检测试剂中所用的ds-DNA不含单链或变性片段且阳性滴度较高时,对SLE特异性可达85%。RA患者阳性率最多为1%;干燥综合征、MCTD阳性率在10%以内。

    3.高滴度抗ds-DNA抗体提示SLE处于活动期。此抗体直接与肾小球细胞内DNA结合或与循环中的DNA结合形成免疫复合物沉积于肾小球基底膜,故与狼疮性肾炎密切相关、特别是当血清补体C3、C4水平降低。

    待测血清最好于采集当日检测。

    抗ENA抗体(antibodies to extractable nuclear antigen,ENA)

    ENA为可提取性核抗原的简称,有三个组成部分:组蛋白、DNA、可溶性核抗原。现已发现有临床诊断价值的包括S(ss-B)、PM-1等10余种抗原,抗ENA抗体为其总称。

    免疫印迹法:正常人血清中抗ENA抗体为阴性。

    目前临床已将抗ENA抗体检测作为结缔组织病的重要诊断标准之一,蛋白质印迹法可同时检测数种多肽抗体,但与免疫电泳法比较其阳性率并无明显提高,因此ENA抗体阴性,不能排除某种风湿病的可能性。

    1.抗Sm抗体主要见于SLE及其重叠综合征,有学者认为抗Sm抗体可作为SLE的标志性抗体,也有报告认为抗Sm抗体阳性的SLE患者,雷诺现象较多,可发生肾脏病变,预后不良,与其相反的观点是抗Sm抗体阳性与SLE活动期和肾脏损害无关,不能 作为判断SLE及临床活动、好转和疗效的依据。

    2.抗RNP抗体见于多种风湿病患者,SLE患者的阳性率30%~50%;PSS25%~30%;皮肌炎10%~20%;RA5%一10%,该抗体滴度通常较低。在混合性结缔组织病(MCTD)患者,阳性率为lOO%。因此,高滴度的抗RNP抗体被认为MCTD的诊断标志。抗RNP,但混合性结缔组织病患者阳性率可达95%~100%,且效价很高。抗RNP抗体阳性与肌炎、食管运动功能障碍、雷诺现象相关,但阳性患者多不发生肾炎。

    3.抗SS-A和抗SS-B抗体为干燥综合征的标志性抗体。

    4.抗Scl-70为全身性硬皮病的标志性抗体。

    5.抗Jo-l抗体被认为是肺病相关肌炎的标志性抗体。

    6.抗Rib抗体主要见于SLE患者,阳性率为10%—40%,在其他疾病中很少出现,可视为SLE的另一标志性抗体

    标本要新鲜,取血后及时检测;所用器皿要清洁,防止蛋白酶对ENA的破坏。

    抗组蛋白抗体(antihistone antibodies,AHA)

    组蛋白是核内最丰富的蛋白质,它与DNA结合组成染色质,无种属特异性和器官特异性,易与DNA、Ig及补体成分结合,正常人群常为阴性。

    ELISA法:正常人血清抗组蛋白抗体为阴性。

    1.抗组蛋白抗体多见于95%的药物性狼疮患者,也见于30%~70%SLE,15%~50%的RA患者。

    2.在Felty's综合征患者中,抗组蛋白抗体检出率可达83%,RA相关的血管炎患者阳性率为75%,青年型类风湿性关节炎(JRA)患者阳性率为20%在非风湿性自身免疫疾病中,原发性胆汁 性肝硬化患者约有76%抗组蛋白抗体阳性。

    3.组蛋白亚型较多,在做组蛋白总抗体检测时,最好同时检测抗H2A、H2B抗体,以排除药物性狼疮。

    抗心磷脂抗体(anti-cardiolipin antibody,ACA)

    抗磷脂抗体是一组针对各种带负电荷磷脂的自身抗体,其中以ACA最为重要。ACA是以心磷脂为靶抗原的一种自身抗体,能干扰磷脂依赖性的凝血过程,抑制内皮细胞释放前列环素,与凝血系统改变、血栓形成、心脑血管缺血性疾病等密切相关。

    ELISA:正常人血清中抗ACA抗体阴性。

    1.ACA阳性主要见于各种自身免疫病(如SLE、类风湿性关节炎、干燥综合征、皮肌炎、硬皮病等)患者中。在肿瘤、AIDS、麻风、疟疾、血小板减少症、脑卒中、心肌梗死、反复自发性流产者、抗磷脂综合征(包括血栓形成、自发性流产、血小板减少、CNS病变等)

    患者中也有较高的检出率,且高滴度的ACA可作为预测流产发生及血栓形成的较为敏感的指标。

    2.从Ig的类型来看,风湿病以IgG型ACA为主;脑血栓患者以IgG型AcA阳性率最高,且与临床密切相关;约70%ACA阳性孕妇可发生自发性流产和宫内死胎,尤其是IgM型ACA阳性可作为自发性流产的前瞻性指标;ACA阳性患者血小板减少发生率明显高于阴性者,以IgG型ACA多见,并与血小板减少程度呈正相关。

    类风湿因子(rheuctor,RF)

    RF是一种以变性IgG为靶抗原的自身抗体,无种属特异性,RF有IgG、IgA、IgM、IgID、IgE5类,以IgM类型多见。

    ELISA:P/N≥2.1为阳性。

    速率散射比浊法:<30kU/L(30U/ml)。

    1. 70%~90%的RA患者RF阳性,但是RF阴性不能排除RA诊断。

    2.除RA外,还有其他疾病也可阳性,如慢性活动性肝炎、干燥综合征、混合性结缔组织病、亚急性细菌性心内膜炎、SLE、多种细菌、真菌、螺旋体、寄生虫、病毒感染等。因此RF阳性时应结合临床全面检查,对其意义进行综合分析。

    3.健康人群中约有5%的RF阳性,70岁以上人群中阳性率甚至高达l0%~25%,但临床意义不太明确。有人认为,RF阳性常早于临床症状许多年出现,这些人患RA的风险较RF阴性的人高5~40倍。

    4.RF可作为自身免疫性疾病的辅助诊断:如RF阳性率SLE为53%、皮肌炎、硬皮病及恶性贫血均为80%、自身免疫性溶血型贫血为75%、干燥综合征可达90%~100%。

    5.各种不同类别RF的临床意义:lgG类RF与RA患者的滑膜炎、血管炎有关;IgA类RF于RA患者关节外症状有关;lgG类、IgA类RF水平升高对进行性关节侵蚀有预测价值。

    抗甲状腺球蛋白抗体(anti-thyroid globulin,Anti-TG)和抗甲状腺微粒体抗体(anti-thyroid e,Anti-TM)

    抗甲状腺球蛋白抗体(A-TG)的靶抗原为甲状腺球蛋白(TG),是由甲状腺上皮细胞合成和分泌的可溶性的碘化糖蛋白,是甲状腺素的生物合成前体。抗甲状腺微粒体抗体的靶抗原为甲状腺微粒体。

    RIA法:Anti-TG<0.30(30%); Anti-TM<O.15(15%)。

    1.抗甲状腺球蛋白抗体主要见于:1自身免疫性甲状腺病:包 括桥本甲状腺炎,阳性率36%~100%;原发性黏液性水肿,阳性率72%;Gravrs病,阳性率50%~98%。2自身免疫性内分泌病:糖尿病,阳性率20%;Addison's,阳性率28%;恶性贫血,阳性率27%。

    3其他:甲状腺癌,阳性率13%一.65%;非毒性甲状腺肿,阳性率8%。SLE等结缔组织病患者血清中检出率为20%~30%。

    2.目前认为.A-TM为人类自身免疫性甲状腺炎较理想的标志抗体,阳性结果可支持自身免疫性甲状腺疾病的诊断。

    3.甲状腺自身抗体尤其是TG和TM抗体的检测,是目前诊断甲状腺疾病的重要方法之一,两者联合检测可相互弥补其不足,对进一步提高阳性检出率、观察病情及判断疗效具有重要价值。

    血液标本采集后,应立即分离血清,贮存于4℃冰箱,如lw内不检测则须置-20℃冷冻保存。未经分离血清的标本在4℃下抗体效价急剧下降。

    抗胰岛细胞抗体(antibody to islet cells of pancreas,ICA)

    ICA主要属于IgG类,能固定补体,有器官特异性,无种属特异性,能与各种动物的胰岛起反应。ICA能与胞质中的抗原结合。

    使胰岛中的各种细胞(a、β、δ)的胞浆呈现均匀的荧光。

    间接免疫荧光法:正常为阴性。

    1.早期诊断指标:少数患者ICA滴度可持续维持很高,数年不变;个别患者起病时为阴性,以后转为阳性;糖尿病近亲阳性率可达l9%,预示其家族成员患病的危险性较大,特发性艾迪生病患者阳性率可达44%;血清ICA阳性是否为亚临床糖尿病或糖尿病前期指标尚未定论;高效价ICA与胰岛B细胞功能破坏有关。

    NID-DM患者阳性率仅6.2%,其他自身免疫性内分泌系统疾病为7 .9%,ICA持续存在5年以上的患者常表现有多种内分泌系统的 其他特征。

    2.ICA在<5岁的患者阳性率90%~100%;>12岁的患者阳性率仅40%。

    抗中性粒细胞细胞浆抗体(anti-neutrophil cytoplasti-bodies,ANCA)

    间接荧光免疫法:正常人为阴性。

    ELISA法:正常人为阴性。

    1.血管炎是以血管壁,主要是动脉发炎和坏死为基本病理改变所致的一组疾病。目前已证实ANCA是存在于血管炎患者血清中的自身抗体,是诊断血管炎的一种特异性指标。

    2.CANCA又称为抗蛋白酶3抗体,主要见于Wegener肉芽肿,阳性率为85%,活动性WG患者在病变尚未影响到呼吸系统时,CANCA灵敏度为65%,当患者出现呼吸系统核肾脏损害时其灵敏度达90%以上,少数未治疗的活动性WG患者CANCA可呈阴性反应,但随病情发展最终将转为阳性,非活动性WG患者CANCA阳性检出率亦可达40%;坏死性血管炎、微小多动脉炎、结节性多发性动脉炎等疾病CANCA也有一定检出率。

    3.PANCA又称为抗髓过氧化物酶抗体,进行性血管炎性肾炎、多动脉炎、Churg-Strauss综合征和自身免疫性肝炎中PANCA阳性率较高,可达70%~80%;PANCA主要与多发性微动脉炎相关,除此之外还见于风湿性和胶原性血管炎、肾小球肾炎、溃疡性结肠炎、原发性胆汁性肝硬化等,在WG患者中少见。

    4.XANCA可见于溃疡性结肠炎、克罗恩病和原发性硬化性胆管炎等。

    注意区别其他类型的自身抗体,如抗Sm、抗UIRNA及抗着丝 点,另外如基底细胞为非中性粒细胞,虽也出现类似的荧光着染,但并非是ANCA,可用ELISA或RIA法加以鉴别。

    抗精子抗体(anti-sperm antibody,ASAb)

    抗精子抗体即可在男性又可在女性体内产生。男性产生ASAb的主要机制是血睾屏障因疾病或创伤受损,使隐藏的精子或其可溶性膜抗原逸出,刺激机体免疫系统产生ASAb。精子对女性是一个同种异体抗原,正常情况下女性生殖道具有能降解精子抗原的酶系统,不引起对精子抗原的免疫反应。当此种酶系统缺陷时,射入**的精子抗原可被**黏膜吸收,诱发全身或局部的免疫应答,致使女性机体产生ASAb。

    正常人多数为阴性;

    试管一玻片凝集试验:≥50%视野出现3条以上精子凝集为阳性;

    精子制动试验:精子制动值≥2为阳性;

    ELISA法:P/N≥2.1为阳性。

    1.检测ASAb因采用方法不同,结果也不相同。通常不孕患者血清中ASAb检出率为20%~30%左右,而在梗阻性无精症患者,ASAb阳性率则可达60%。

    2.ASAb阳性也可见于其他原因,如输精管梗阻以及睾丸和附睾的损伤和炎症。鉴于ASAb的异质性以及其中很多ASAb针对的靶抗原与生育并不相关,因此,对ASAb的阳性结果必须结合临床表现综合考虑。

    标本收集禁欲3~5d后男性之精液。

    试管一玻片凝集试验:精子悬液不宜太浓,否则凝集程度不易判断;标本置37℃水箱时要加塞,以免水滴落人影响结果;镜检前 摇动要轻,太大易出现假阳性;标本要新鲜,陈旧或污染标本易出现假阳性。低滴度ASA不易出现凝集反应。

    抗子宫内膜抗体(anti-endometrium antibody,AEA)

    ELISA法:正常人为阴性,P/N≥2.1为阳性。

    1.正常情况下子宫黏膜不诱发机体产生自身免疫应答反应.剖宫产、刮宫手术及某种病理情况下,月经通过输卵管逆流均可导致子宫内膜异位症,引起自身免疫病理反应,产生AEA,此抗体常会加重疾病进程,并干扰生育功能。子宫内膜异位症I期、2期患者AEA检出率可达60%~86%,而在合并不孕的I期患者,阳性率可达90%。在不明原因的不孕中,AEA阳性率达73.9%。

    2.AEA也见于反复自然流产、原因不明的不孕症、子宫肌瘤、盆腔炎。

    3.由于ANA靶抗原的本质和生理功能仍不清楚,对ANA临床意义的评价应结合患者临床情况和其他检查综合考虑。